测序技术的发展是否已走到尽头？
(2018-10-07 17:41:17) | 标签： | 分类： |
你可能听说人类基因组计划（HGP），在介绍这个项目的时候，一般都会提到这一事实：这一计划共斥资30亿美元的巨资，绘制完成了首个人类基因组参考图谱。按人类基因组30亿个碱基来算，就是“一个美元，一个碱基”（One buck, one base）。
如果你关注基因组领域，你一定还听说过$1000美元基因组这一说法。花费1000美元就能完成一个人的基因组测序，是HGP计划完成后基因组技术发展的重要目标。
这次就来聊聊与这一目标有关的一些事，并尝试回答一个老问题，那就是测序技术的发展是否走到尽头？同时，也不妨畅想下未来。
一、$1000基因组这一目标的缘起
2001年，在人类基因组计划框架图完成后，国际基因组科学家提出了一个在当时看来遥不可及的目标，即一千美元完成一个人类基因组测序。
现有资料显示，这一说法首先出现在一次学术会议上。这次会议由美国国家人类基因组研究所（NHGRI）组织，讨论的主要议题是人类基因组计划完成后相关研究的未来方向。会上有学者提出，完成一个人类的基因组测序，1000美元的测序费用是一个可以负担得起的水平；只有达到这个水平，基因组技术才有望应用于疾病诊断。
这个说法，凸显了当时技术层面的鸿沟：如果以完成人类基因组计划的30亿美元基准，要降到1000美元，意味着测序成本需要降低至少6个数量级。
这个在当时看来不可能完成的任务，在国际同行的共同努力下，如今已经毫无悬念，因为目标已经实现。
二、NIH的行动 [yě xīn]：$10000基因组与$1000基因组计划
NHGRI在2003年正式启动了“十万美元一个基因组”和“一千美元一个基因组”的测序技术鼓励计划，即 $100,000 Genome和 $1000 Genome，官方名称是Advanced Sequencing Technology awards，用于奖励最先进的测序技术的开发。
上述目标预计将分两阶段实现：用五年时间，到2008年，实现10万美元一个基因组的目标；在下一个五年也就是2013年，通过技术革新，实现1000美元一个基因组目标。这个“基因组“是指人类基因组大小的基因组，并不专指人类基因组。
该计划目标的设定是以完成一个人类基因组大小的复杂基因组的高质量框架图为基准【7.7倍覆盖度，其中Q20碱基达到6.5倍覆盖度，组装成了22.5万序列重叠群，通过至少2个序列对将这些重叠群组装成了7418个超级重叠群, 重叠群N50为24.8Kb, 超级重叠群N50为16.9Mb】。计划提出之时（即2003年夏），要达到上述标准所需要的费用约为5000万美元。测序费用要在此基础上降低4～5个数量级，才能实现“一千美元一个基因组”的目标。由于在此之前的十余年间，测序费用已下降至少100倍。这样总体算下来，与1990年人类基因组计划刚刚启动时相比，测序费用要降低至少6个数量级。
NHGRI于2004年公布第一批获奖者，2014年公布了最后一批，前后共有100余个项目项获奖。每一项资助力度约为几百万美元。这一总耗资约为2.3亿的计划，成果斐然。
翻看获奖者名单，可以看到Illumina, Ion Torrent, 454毫无例外均在其中。一些新锐技术团队，如PacBio、NABsys、GnuBIO、Stratos Genomics等，也都曾得到资助。
这一计划为测序技术提供了创新的土壤，知识交流与资讯分享的平台。每项资助其实并不足以将一项新技术从实验室阶段转化成商业产品，主要是帮助实现关键技术上突破。一些获奖者，如PacBio创始人Stephen Turner，还以此为契机拿到了风投，帮助其技术成功实现了市场转化和商业化运作。
当然还有一些获奖技术尚未成功应用，一些技术如454和Helicos没有通过市场的考验。不过这些技术对行业有一定启迪与借鉴意义。一些获得资助的团队被更大的公司收购，例如Illumina就收购了好几家获奖公司。这些团队和技术人员对整个行业起到了一定的促进作用。
三、民间的努力[rèn xìng]：Craig Venter与基因组X大奖
2002年10月，Craig Venter在美国召开的GSAC 基因组测序与分析大会上，提出了未来测序技术要实现“一千美元一个基因组”的目标。次年，他又宣布其基金会将出资50万美元用于奖励这方面的技术进步，这笔资金随后注入基因组X大奖赛（Archon Genomics X PRIZE ，由美国加州的 X大奖基金会与Venter 共同设立的奖项）。
这一竞赛项目于2006年启动，旨在鼓励开发快速、准确而实用的测序技术。用于测试的标本来自全球100位百岁老人（想必是希望这批数据能够有助于人类疾病与健康研究）。参赛者需要在30天内完成这100人的全基因组测序工作，全基因组覆盖率达到98%，错误不超过百万分之一，能够鉴定插入/缺失重、组并获得完整的单倍型，且每个基因组的花费不高于1000美元。率先实现这一目标的团队将获得1000万美元的奖励。
基因组X大奖赛在启动伊始颇有声势，但在2013年8月却被取消了。赛事发起人认为当时测序技术的创新速度已经超越了比赛目标的设定（Outpaced by innovation）,使得竞争变得毫无意义。当时据说这是X大奖赛有史以来第一次取消赛事。
那批珍贵的百岁老人血样标本后来被制备成了细胞系，用以长期保存其DNA，赛事组织方仍希望日后有机会对其基因组进行研究，也有意愿共享相关数据。
四、测序技术的发展是否已到尽头？
早在人类基因组计划刚刚完成后，就有人提出过这个问题。
杨焕明院士在《基因组学》一书中，记录了一位日本科学家如此描述当时的主流意见：“对HGP的完成，日本和美国科学家的反响大相径庭，美国人认为这只是刚刚开了个头，而日本人却认为测序技术已经走到了尽头，因而放弃了本来仪很有基础的进一步开发，尽管日本日立公司已经开发了可与ABI 3700媲美的毛细管测序仪。”
其实，测序技术发展早期不乏日本人的身影。《科学》杂志在其2001年的述评《人类基因组计划简史》中，专门提到了时任日本理化研究所（RIKEN）的生物物理学家和田昭允（Akiyoshi Wada）。和田昭允在1982年就率先提出了测序自动化的设想，并得到了日立公司的支持来开发相关设备。我曾经很奇怪为什么后来市场上一直没有日本测序仪，如今看来正是日本当时对技术发展的观念使其错失了这一领域的发展机遇。
如今，距离HGP完成又过去十多年，测序技术也实现了当初$1000基因组的宏伟预想，为其后续应用扫清了经济上的障碍。基因组测序已经不再是一件遥不可及的事情，个人基因组、人人基因组时代已悄然而至。一批成功的先导性应用，如NIPT、肿瘤液态活检等，更使得这一技术走进社会大众的视野。
那么，此时测序技术是否走到了尽头呢？
从基因科技、精准医学等相关领域发展趋势，以及人类对数据的巨大胃口来看，测序应用还会大幅度增长，测序技术依然有很大发展空间，有很多方面还需要改进、完善与突破，测序与数据分析及存贮的成本也有待近一步下降。作为解析人类自身、解析生命的重要工具之一，测序技术离我们对它的期望，尚有一定距离，所以我们仍在热切期盼下一个颠覆性创新，特别是来自我们中国的创新。
在国际基因组科技领域，我国起步相对较晚，基础较弱，早期更多的是一个参与者、跟随者的身份，行业话语权十分有限。经过不懈努力，我们目前在基因组科技领域已走在国际前沿，同时也具备了测序技术研发和生产制造能力。加之我国在其他相关技术领域如移动通讯等方面已有的基础，以及创新环境与利好政策，我们完全有机会在基因组技术方面取得更大成就。
五、对测序技术发展的一些畅想
此前，测序技术的发展更多的是由科学需求所带动（如人类基因组计划、攻克癌症）、由新技术所推动（如纳米孔技术），以及人类自身的好奇心、好胜心所驱使。接下来测序领域将迎来的颠覆性创新，很可能将由应用特别是是杀手级应用、而非新技术本身所驱动。
目前，主流测序设备一般体积较大，需要配套标本制备设施以及数据处存贮和处理的计算机系统，所以通常称之为测序平台。这类测序仪属于精密设备，安装好就一般就在固定位置长期使用，不轻易搬动。对于科研特别是大型基因组项目，这种测序平台依然十分必要。由于这类工作涉及对标本的集中分析，因此对测序仪的性能、通量都有较高要求；此外，还要能够发现基因组的各类变异，所以对分辨率、准确性要求也很高。除研究机构外，第三方医学检测机构也需要这类平台，以满足大量标本的集中式检测。集中测序无疑有助于提高分析效率，节约成本。从科研和集中检测角度来看，测序技术还有进步的空间（比如在单分子测序、单细胞和微量与痕量标本测序、多组学测序、生物体内测序等方面，测序成本越低越好）。
不同的应用场景会对测序技术提出不同的需求，很可能会出现适合普通非专业用户使用的测序仪（我自己就很想有一台），或者适用于某种特定应用的测序仪，只需要简单的操作，就能够在很短的时间内回答用户想知道的问题，比如是否存在某些病毒感染，或者某种异常核酸分子（如循环肿瘤DNA）数量的多少等等。当测序成本降到更低的时候（如千元人民币、百元人民币、乃至更低），测序仪很可能成为实现互联的智能化设备，就像现在的电脑和智能手机一样。或许，还可以实现与其他智能设备的整合、或者嵌入其他设备。比如，有学者就提出了智能厕所的概念，利用卫生间这一独特的居家场所，通过对人体排泄物等生物标本进行检测，来监测人体健康状况、居家环境（如供水是否存在病原体污染等情况）。
测序仪小型化、甚至微型化的趋势已在显现。对于这种小快灵、造价低的小微型测序仪，有学者提出了测序传感器的概念。目前，已经有几款可以双手执握的测序仪问世或已开发出原型机。这些笔记本、甚至优盘大小的测序仪，体积小、可携带，这就味着测序技术将走出实验室，在更多的地方得以应用（比如家用、野外使用），使用者也不再限于专业人士。要达到个人电脑和手机那样的普及程度，测序设备价格不应该太高；此外，普通用户对测序的通量、准确性的要求不会像专业人员那么高，但出结果的速度却一定要快。测序标本处理也要更加简单化，最好能有类似血糖检测那样的一次性使用试剂耗材，标本用量小、试剂安全、不需要复杂的配置过程与苛刻的保存条件；同时，数据分析与结果展示要智能化与用户友好。
六、小结
在人类基因组计划完成后，HGP计划领导人之一、时任NHGRI所长的Francis S. Collins 等发表了《基因组研究之未来展望》一文，提出了基因组研究从基因组结构到基因组生物学、直至服务人类健康的路线图，以最终实现其经济和社会效益。
这里分享文中的一句话：在基因组研究中，我们学会了期待意想之外的事情。从过去的经验来看，如果生物学、医学以及社会环境完全按照预测去发展，将会令人诧异（并令人失望）。现实要求我们定期重新审视未来基因组研究这一愿景。（原文 “Furthermore, in genomics research, we have learned to expect the unexpected. From past experience, it would be surprising (and rather disappointing) if biological, medical and social contexts did not change in unpredictable ways. That reality requires that this vision be revisited on a regular basis.” ）
主要参考资料：
1. Collins FS1, Green ED, Guttmacher AE, Guyer MS; US National Human Genome Research Institute. Nature. 2003 Apr 24;422(6934):835-47. Epub 2003 Apr 14. A vision for the future of genomics research.
2. Erlich Y. A vision for ubiquitous sequencing. Genome Res. 2015 Oct;25(10):1411-6.
3. Green ED, Rubin EM, Olson MV. The future of DNA sequencing. Nature. 2017 Oct 11;550(7675):179-181.
4. Roberts L, Davenport RJ, Pennisi E, Marshall E. A history of the Human Genome Project. Science. 2001 Feb 16;291(5507):1195.
5. 基因组学.杨焕明.北京：科学出版社,2016.10. ISBN: 978-7-03-049902-8
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